摘 要：目的 制備白藜蘆醇**（BTM）脂質體，對其質量特性進行評價，并考察脂質體對BTM的增溶作用。方法 采用薄膜分散法制備BTM脂質體，以包封率為評價指標，通過正交設計優化**工藝，微柱離心法測定其包封率，觀察其形態、粒徑及穩定性，并考察其對BTM的增溶作用。結果 優化的*佳**工藝：**與磷脂質量比為1∶20，膽固醇與磷脂比為1∶4，水化介質為5%甘露醇；按該**制備的脂質體包封率達（86.4±2.2）%；與游離BTM相比，BTM脂質體在水中的溶解度增大了1 012多倍。結論 采用*佳**制備得到的BTM脂質體包封率較高，形態和粒徑較均勻，脂質體可以較好地提高BTM的溶解度。
關鍵詞：白藜蘆醇**；薄膜分散法；微柱離心法；包封率；正交設計
白藜蘆醇**（3, 5, 4′-trimethoxy-trans- stilbene，BTM）是白藜蘆醇的全甲基化衍生物，具有明顯的抗新血管生成、抗有絲分裂作用，可以引起微管分解和微管蛋白解聚，用于抗腫瘤**。此外，BTM具有抗過敏、保護胃粘膜損傷以及抗衰老作用[1-3]。但是BTM難溶于水，光照下易發生異構化并降解，使其應用受到限制[4]。脂質體可以增加難溶性的**的溶解性，提高光不穩定性**的光穩定性[5-6]。本實驗將BTM制備成脂質體，對其**工藝和質量特性進行評價，并考察脂質體對BTM的增溶作用。
1 儀器與材料
LC20A—DAD高效液相色譜儀（日本島津），N—1100 旋轉蒸發儀（東京理化器械公司），Digital sonifier S—450D超聲波細胞粉碎機（美國Branson Sonifier），Nano—ZS90激光散射粒徑儀（英國Malvern公司），Sirion 200場發射掃描電鏡（荷蘭FEI公司）。BTM對照品（質量分數99.2%，中南大學化學化工學院提供），BTM樣品（中南大學化學化工學院提供），卵磷脂（S100，德國Lipoid公司），膽固醇（天津博迪化工有限公司），葡聚糖凝膠G-50（北京瑞達恒輝科技發展有限公司），乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 BTM脂質體的制備
采用薄膜分散法[7-8]。精密稱取適量磷脂、膽固醇、BTM于茄形瓶中，加入10 mL氯仿溶解后，旋轉蒸發除去氯仿，使形成均勻透明的薄膜，加入5%甘露醇溶液15 mL，45 ℃水浴下水化4 h，使薄膜溶脹充分水合完全，得乳白色混懸液；探頭超聲2 min，0.45 μm微孔濾膜擠出，即得BTM脂質體。
2.2 BTM定量測定方法的建立
2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（75∶25），柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL/min，檢測波長318 nm，進樣量20 μL。
2.2.2 專屬性試驗 分別取空白脂質體、BTM乙腈溶液、BTM脂質體各0.2 mL，甲醇破乳并稀釋至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣測定。結果表明，在此色譜條件下，脂質體輔料對BTM定量測定無干擾。
2.2.3 線性關系考察 精密稱取BTM對照品10.0 mg于50 mL量瓶中，加乙腈溶解稀釋至刻度，得質量濃度為200.0 μg/mL的BTM儲備液。精密量取上述儲備液適量，乙腈稀釋成質量濃度分別為0.1、0.4、1.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL的系列溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，以色譜峰峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程A＝134 298.1 C－588.8，r＝0.999 9，表明BTM在0.1～32.0 μg/mL線性關系良好。
2.2.4 精密度試驗 分別配制質量濃度為1.0、8.0、32.0 μg/mL的BTM乙腈溶液各5份，按“2.2.1”色譜條件測定，計算日內精密度和日間精密度。日內精密度RSD分別為0.27%、0.43%、0.19%，日間精密度RSD分別為1.46%、0.77%、0.65%。
2.2.5 穩定性試驗 取BTM脂質體混懸液適量，加甲醇稀釋至質量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，在0、2、4、6、8、12 h分別測定BTM的峰面積，計算其RSD分別為1.38%、1.06%、0.59%，表明供試品溶液在12 h內穩定。
2.2.6 重復性試驗 取BTM脂質體混懸液適量，加甲醇稀釋至濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件，連續測定5次，其質量濃度基本無變化，RSD分別為0.87%、0.23%、0.35%。
2.2.7 回收率試驗 精密吸取0.2 mL空白脂質體于5 mL量瓶中，分別加入25、200、400 μL質量濃度為200.0 μg/mL的BTM乙腈儲備液，加入甲醇破乳并稀釋至刻度，重復3次，得質量濃度分別為1.0、8.0、16.0 μg/mL的樣品溶液，分別進樣測定，計算回收率。3種質量濃度的回收率分別為101.3%、99.3%、99.6%，RSD分別為0.39%、1.53%、0.57%。
2.3 微柱離心法[9-11]測定BTM脂質體的包封率
2.3.1 微型凝膠柱的制備 稱取葡聚糖凝膠G-50 1.0 g于適量蒸餾水中，浸泡24 h，沸水浴煮沸20 min，使葡聚糖充分溶脹并除去氣泡。靜置冷卻后，裝填于2.5 mL注射器（底部填有適量脫脂棉）中，于離心機中3 000 r/min離心5 min，備用。
2.3.2 洗脫曲線的考察 精密吸取BTM脂質體混懸液0.2 mL，加于微柱的頂部，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 mL蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復以上操作。從第12管開始更換洗脫液，用乙醇-水（3∶2）混合溶劑代替蒸餾水作為洗脫液，操作同上，繼續收集10管洗脫液。所收集的洗脫液用甲醇破乳并稀釋定容至5 mL。按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定A B C 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12 0 2 4 6 10 12t/ min **
BTM質量濃度，以洗脫管號為橫坐標，BTM質量濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線，結果見圖2。可知脂質體在前8管基本洗脫完全，BTM游離**則在第13管以后被緩慢洗脫，可見葡聚糖G-50微型凝膠柱可較好地分離脂質體與BTM游離**。該方法可用于BTM脂質體包封率的測定。
2.3.3 包封率的測定 精密量取BTM脂質體混懸液0.2 mL于微柱中，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；再于柱頂部加入0.2 mL蒸餾水，2 000 r/min離心3 min，收集洗脫液；重復以上操作。合并1～8管洗脫液，甲醇稀釋破乳后定容至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定BTM質量濃度，記為C脂；另取BTM脂質體混懸液0.2 mL，加入甲醇超聲破乳，破乳后甲醇定容至5 mL，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，測定BTM質量濃度，記為C總，計算包封率。包封率＝C脂/ C總C脂為包封于脂質體中的**質量濃度，C總為脂質體混懸液
中**的總質量濃度
2.4 單因素考察
2.4.1 藥脂比對包封率的影響 固定膽固醇與磷脂的比為1∶3、水化介質為5%甘露醇、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取BTM與磷脂的質量比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制備脂質體，測定包封率分別為46.5%、70.9%、73.6%、77.4%、77.6%。結果表明，藥脂比在1∶10以下時包封率可達70%以上。
2.4.2 膜材比對包封率的影響 固定藥脂比為1∶20、水化介質為5%甘露醇、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取膽固醇與磷脂的比分別為1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶1制備脂質體，測定包封率分別為68.8%、70.4%、80.2%、75.1%、38.6%。結果表明脂質體的包封率隨著膽固醇嵌入量的增加呈現先增加后減少的趨勢。膽固醇對于脂質體起著膜流動性調節劑的作用，能適當提高**包封率和穩定性。但當膽固醇的量過大時，與脂溶性**BTM競爭磷脂雙分子層位置，導致包封率下降。
2.4.3 水化介質的種類對包封率的影響 固定膽固醇與磷脂的比為1∶3、藥脂比為1∶20、水浴溫度45 ℃、水化時間4 h，選取水化介質分別為5%甘露醇、0.01 mol/L PBS、蒸餾水制備脂質體，測定包封率分別為78.2%、69.4%、72.7%。結果表明，水化介質為5%甘露醇時，脂質體的包封率*佳。
2.5 正交設計優化**
在文獻資料[12]及單因素考察試驗基礎上，以包封率為指標，選擇**與磷脂質量比（A）、膽固醇與磷脂比（B）、水化介質的種類（C）為考察因素，每個因素各取3個水平，進行正交設計，選用L9(34) 正交表安排試驗，制備脂質體，測定包封率。。由正交試驗結果分析可知，影響脂質體包封率的因素順序為C＞A＞B，*佳**為A3B2C1，即**與磷脂比為1∶20，膽固醇與磷脂比為1∶4，水化介質為5%甘露醇。
2.6 *佳**工藝的驗證
按上述篩選得到的*佳**，制備3批BTM脂質體混懸液（約相當于BTM 0.33 mg/mL），測定包封率分別為88.7%、84.3%、86.2%。3次驗證試驗的結果基本一致，說明所確定的優化**合理可行，重現性良好。
2.7 BTM脂質體形態
取*佳**制備的BTM脂質體適量，用超純水稀釋100倍，以掃描電鏡觀察脂質體形態。可見脂質體形態圓整，多為球形及類球形粒子，大小較均一。
2.8 粒徑和Zeta電位的測定取*佳**制備的BTM脂質體適量，適當稀釋后，用激光散射粒徑儀測定脂質體的平均粒徑和Zeta電位。脂質體的平均粒徑為（183.6±2.1）nm，PDI為0.265±0.006，Zeta電位為（−15.3±1.2）mV。
2.9 初步穩定性考察
取*佳**制備的BTM脂質體3批，置于（4±1）℃冰箱中，于3、5、10 d取樣，分別考察外觀、粒徑、Zeta電位和包封率的變化。結果BTM脂質體在4 ℃條件下放置10 d后，外觀沒有發生明可以看出，低溫放置10 d，脂質體的外觀、粒徑及Zeta電位沒有發生明顯的變化，包封率略有降低。
2.10 增溶作用
取過量的BTM原料藥置于具塞試管中，加入超純水，渦旋使分散均勻，于（25±1）℃的恒溫振蕩器中48 h，平衡后取樣，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.2.1”下色譜條件進樣分析，測得BTM在純水中的飽和溶解度為0.32 μg/mL。取適量BTM脂質體于西林瓶中，加入10%蔗糖溶液作為凍干保護劑，冷凍干燥，得到凍干脂質體。取過量凍干粉于純化水中，振搖復溶使分散均勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，加入甲醇破乳后，按“2.2.1”下色譜條件進樣分析，測得BTM脂質體中**的飽和溶解度為324.2 μg/mL。BTM脂質體較其原料藥在水中的飽和溶解度提高了1 012多倍，表明脂質體對BTM有較好的增溶作用。
3 討論
BTM難溶于水，為脂溶性**。薄膜分散法簡單易行，適合于脂溶性**脂質體的制備。本實驗采用該法制備BTM脂質體，通過正交實驗篩選*佳組成。制備過程中，成膜和水化是影響脂質體包0.1 1 10 100 1 000 粒徑/ nm −200 −100 0 100 200Zeta電位/ mV 封率與粒徑的關鍵步驟。成膜太厚、水化不完全，制得的脂質體粒徑偏大，放置易聚集，影響脂質體的穩定性；成膜不均勻，導致**未能很好地嵌入脂質體雙分子層中，影響脂質體的包封率。脂質體包封率的測定方法通常有凝膠柱層析法、透析法、超速離心法、微柱離心法等[9-11,13]。凝膠柱層析法消耗時間長，且不易控制洗脫液的體積流量；透析法消耗時間也較長；超速離心法要求較高離心力才能將脂質體和游離**分離。微柱離心法是一種快速、簡便地分離脂質體中游離**的方法，其優點是脂質體混懸液幾乎沒有被稀釋，可以避免脂質體的滲漏。本實驗采用微柱離心法測定BTM脂質體的包封率，脂質體與游離**分離效果好，方法簡便，重復性好。采用*佳**制備的3批脂質體，包封率較高，粒徑分布均勻，重現性良好，并且可以顯著提高BTM的溶解度。放置10 d后，外觀和粒徑均未發生明顯的變化，但包封率略有降低，推測**可能出現滲漏。將脂質體凍干，可以顯著降低磷脂的水解和氧化速率，提高脂質體的穩定性[14]，實驗擬進一步考察BTM凍干脂質體貯存穩定性。
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